Un nuevo dispositivo de pruebas genéticas basadas en teléfono inteligente puede identificar rápidamente los agentes patógenos que causan infecciones asociadas a la salud, dicen los investigadores.
En un ensayo clínico piloto, el nuevo sistema, el diagnóstico de la polarización de anisotropía (PAD), resultó comparable a la de un cultivo bacteriano, informe Ki Soo Park, PhD, de la Escuela de Medicina de Harvard en Boston, Massachusetts, y sus colegas.
"En contraste con la cultura, el ensayo PAD fue rápido (~ 2 horas), multiplexado, y rentable (<2 $ por ensayo)", escriben en un artículo publicado en la edición del 6 de mayo la ciencia avanza .
Cada día, 1 de cada 25 pacientes hospitalizados adquiere una infección, los investigadores han señalado. Puede ser difícil de averiguar qué bacterias son los culpables, y por lo tanto el tratamiento a prescribir.
El método tradicional requiere el cultivo de las muestras de pacientes en agar durante hasta varios días.
reacción en cadena (PCR) de amplificación de la polimerasa de nucleótidos bacterianas funciona más rápido, pero es más caro y puede ser complicado de usar. sistemas automatizados existentes son voluminosos, según los autores, y la técnica es susceptible de falsos positivos resultantes de la contaminación, por lo que las áreas pre-y post-PCR tienen que ser alojadas en diferentes lugares.
Por lo tanto, los investigadores se dispusieron a inventar un sistema más económico más rápido, más móviles. Ellos vinieron con PAD, que mide los cambios en la anisotropía de fluorescencia cuando las sondas de detección reconocen ácidos nucleicos diana bacteriana.
El sistema es radiométrica e independiente de la intensidad de fluorescencia, lo que limita su susceptibilidad al ruido ambiental.
Consiste en un dispositivo compacto con un cartucho desechable para la preparación de muestras y la detección de múltiples pocillos. Está optimizado para llevar a cabo la amplificación de ácido nucleico y la detección sin etapas de lavado. El equipo también integra un control de la contaminación en el protocolo de ensayo. El usuario extrae material genético de una muestra, tal como un fluido de una infección. El dispositivo amplifica este material usando transcripción inversa asimétrica en un cubo de plástico desechable, que mide alrededor de 2 × 2 cm.
Las sondas de ácido nucleico a detectar secuencias genéticas que definen de forma única una bacteria causante de la enfermedad. Los inventores han creado hasta ahora más de 35 sondas específicas de secuencia para evaluar la carga bacteriana, tipos, resistencia a los antibióticos, y la virulencia.
Una sonda indicadora unida a una etiqueta fluorescente genera una señal luminosa. Cuando el dispositivo detecta una muestra con copias de una secuencia bacteriana de destino, que mide la señal de luz y la envía a la estación base electrónica, donde se digitaliza y se transmite a un teléfono inteligente con una aplicación de PAD.
Esta aplicación convierte los datos en un informe con un sello de tiempo y coordenadas de posición globales. Todo el proceso dura menos de 2 horas.
Para probarlo, los inventores aplicaron PAD para detectar bacterias gram-negativa Escherichia coli , Klebsiella pneumoniae , Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa y Gram-positivos Staphylococcus aureus .
Se definen la salida PAD como Δ r = r 0 - r , donde r es la anisotropía de fluorescencia de la muestra y r 0 . Es la anisotropía de fluorescencia de muestras de control que contienen ADN polimerasa y sólo el reportero Continue Reading
A través de diferentes especies bacterianas, los autores observaron Δ consistentes r valores de concentración en las muestras de concordancia, con P = 0,8857. Este resultado apoya el uso de la PAD en la estimación de la carga bacteriana total.
Se realizaron experimentos de titulación siguiente con muestras de bacterias diluidas en serie. El rango dinámico del ensayo de PAD se extendió por más de 10 4 unidades formadoras de colonias (UFC); el límite de detección fue a las UFC de un solo dígito.
A continuación, los autores probaron la eficacia del sistema de control de contaminación, que funciona mediante la sustitución de trifosfato de desoxitimidina con trifosfato de desoxiuridina durante la PCR para procesar todos los amplicones tener una cadena principal de ADN que contiene uracilo.
Ellos se dispararon muestras con trifosfato de desoxiuridina que contiene productos de PCR. El control negativo sin objetivos bacterianas mostró falsos positivos, pero esta señal fue eliminado con la adición de glicosilasa uracilo-ADN, que escinde estos amplicones, la destrucción selectiva de los contaminantes mientras se mantiene las plantillas de ADN de buena fe. Sólo las muestras que contienen los verdaderos bacterias tenían alta Δ r .
Para diferenciar los patógenos causantes de infección adquirida cuidado de la salud, los autores utilizaron teclas que se dirigen a las regiones hipervariables de los rRNA 16S en diferentes especies bacterianas. Ellos encontraron que éstos alcanzan una alta especificidad. Por ejemplo, la Escherichia clave mostró una alta Δ r solamente con su objetivo previsto.
Los inventores tuvieron el mismo éxito en el uso de las teclas que se dirigen a los genes bacterianos, lo que los antibióticos o muy virulenta. Ellos fueron capaces de detectar los genes que confieren resistencia a múltiples fármacos en Staphylococcus aureus y factores de virulencia que contribuyen a su patogenicidad.
Por último, los investigadores probaron el dispositivo en muestras de fluidos o de nefrostomía abdominales procedentes de nueve pacientes y se compararon los resultados con los de un laboratorio de patología clínica. El laboratorio utiliza tanto la cultura como la PCR cuantitativa para detectar patógenos en las mismas muestras.
El PAD y el laboratorio de patología tanto detectaron infecciones en tres de los pacientes. En otros tres, ambos detectado Escherichia , y en otro, ambos detectan Escherichia , así como Klebsiella .
En otro paciente, el PAD y de laboratorio tanto detectaron Staphylococcus con factores de virulencia.
En un paciente, el PAD detecta una infección, pero no pudo hacerlo coincidir con un patógeno. El laboratorio informó de la infección con Providencia , que no se encontraba entre las bacterias del PAD tenía la misión de identificar.
Este trabajo muestra que la PAD es escalable para la detección integral, informan los inventores. Un reportero de fluorescencia común puede ser utilizado para todos los objetivos de detección, y el costo incremental de objetivos adicionales es de sólo $ 0,01, que escriben.
A pesar de la alta concordancia con los informes de laboratorio, los investigadores observaron algunas limitaciones. En primer lugar, se encontró que ninguna de las muestras clínicas para contener las cepas resistentes a los medicamentos, por lo que la capacidad de la PAD para llevar a cabo esta detección permanece sin probar.
En segundo lugar, la almohadilla puede mostrar resultados ambiguos cuando los ácidos nucleicos diana se superponen. Por ejemplo, las claves actuales no podían distinguir SARM adquirido en la comunidad de la mezcla de la asistencia sanitaria adquirida-multirresistente S aureus meticilina y susceptible S aureus . Ellos esperan resolver este problema a medida que más datos genómicos bacterianas se producen mediante la secuenciación de todo el genoma.
El informe fue elogiado por Francis Collins, MD, PhD, director de los Institutos Nacionales de Salud, que financió parcialmente la investigación.
"El surgimiento de bacterias resistentes a los antibióticos es un problema de salud pública, especialmente urgente", escribió en su blog de .
"Hay una necesidad crítica de nuevas y mejores herramientas para la detección de infecciones bacterianas y su resistencia a determinados tratamientos antibióticos temprano. Esta nueva tecnología, y otros como él, proporcionar esperanza de que podemos ganar esta importante batalla."
El estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, el Departamento de Defensa, la Fundación Nacional de Investigación de Corea, y el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación futura de Corea. Los autores han declarado no tener ningún conflicto de intereses.
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